Достоверность Анализа На Бешенство

Анализ на бешенство у котов

Существует ли анализ на бешенство у кошек и как своевременно распознать болезнь? Бешенство или водобоязнь – опасное заболевание, которое вызывает вирус Rabies, было известно еще древним восточным врачевателям. Прошли столетия, но до сих пор этот вирус продолжает держать в страхе всю планету. Защититься от заражения человеку помогает антирабическая вакцина, но она эффективна только когда недуг находится в инкубационном периоде. А как же быть с нашими мурлыкающими питомцами, которые не защищены от контактов с вирусоносителями? Какие способы диагностики бешенства существуют?

Как передается и проявляется кошачье бешенство

Кошка может заразиться бешенством от укуса зараженного дикого зверя или домашнего питомца, кошки или собаки; съев дохлую зараженную крысу или мышь. Проникнув в организм кошки, вирус достигает нервных волокон. Через них он устремляется к головному мозгу, где начнет размножаться. Постепенно вирус расходится по всему организму. Нарушения, которые вызывает бешенство, не обратимы. В результате функционирования вируса в организме нейроны головного мозга погибают, что приводит к смерти заразившегося.

Первые симптомы заболевания появляются после завершения инкубационного периода. Но кошка представляет угрозу для человека еще в самом начале заражения. Она может укусить или поцарапать, что приведет к еще одному заражению. Болезнь может иметь разные формы: буйную, тихую и атипичную. Характерными симптомами бешенства являются:

• обильное слюнотечение, которое приводит к намоканию шерсти;
• гидрофобия,
• отсутствие или извращение аппетита,
• отвисание челюсти, неровная походка,
• нападение животного на встречных людей, собак и кошек.

Как диагностировать болезнь

Определить бешенство у кота не просто. Если вы заметили за своим животным неадекватное поведение, признаки которого схожи с бешенством, нужно держаться от него подальше. Ведь теперь кошку нельзя будет остановить привычными способами, а для вас она будет представлять смертельную угрозу. Следующим шагом должен быть вызов ветеринарной службы, которая поможет изловить кота. Важно понимать, что достоверной прижизненной диагностики бешенства не существует.

После отлова животное помещают в отдельную клетку, где непрерывно наблюдают за его поведением. В случае подтверждения диагноза, кошку усыпляют. При анализе крови кошки на бешенство ткани мозга после ее смерти исследуют на наличие телец Бабеша-Негри. После появления первых симптомов бешенства, кошка обречена на смерть. Проводить лечение и изъятие крови у живого животного при подозрении на бешенство не станет ни один врач. Причина этому – слишком высокий риск заразиться.

Как защитить кошку от заражения

Единственным методом профилактики бешенства является введение специальной антирабической вакцины, которая защитит кошку от заражения. Вакцинацию можно проводить котятам с трехмесячного возраста после того, как у них выпадут зубки. Взрослым котам и кошкам вакцину вводят ежегодно.

Прививают только здоровых животных. Беременным и кормящим кошкам вакцинироваться нельзя. Получить прививку от бешенства можно в любой ветеринарной клинике. Иммунитет после вакцинации сохраняется от 12 до 36 месяцев.

Анализ на антитела к бешенству необходим при вывозе животного в другую страну. Для исследования используется кровь кошки, с помощью которой можно определить привита она или нет. Положительный результат анализа крови говорит о наличии иммунитета у кошки перед бешенством. Средняя стоимость анализа на бешенство у кота составляет около 1000 рублей. Пройти экспресс-тест также можно в специализированных ветеринарных клиниках.

Первые симптомы заболевания появляются после завершения инкубационного периода. Но кошка представляет угрозу для человека еще в самом начале заражения. Она может укусить или поцарапать, что приведет к еще одному заражению. Болезнь может иметь разные формы: буйную, тихую и атипичную. Характерными симптомами бешенства являются:

Диагностика бешенства животных методом иммуноферментного анализа, сравнение прямого и непрямого сэндвич-варианта

Сухарьков А.Ю, Назаров Н.А., Метлин А.Е. ФГБУ ВНИИЗЖ

Бешенство — острая инфекционная болезнь животных и человека, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Бешенство регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

Диагностика бешенства играет важную роль для оказания своевременной постэкспозиционной лечебной помощи людям и борьбы с бешенством среди животных [7]. Она должна быть быстрой и достоверной, так как это необходимо для оценки риска, который угрожает людям.

В настоящее время базовыми методами диагностики бешенства являются реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и биологическая проба на мышах, а также выделение вируса на культуре клеток, постепенно заменяющее биологическую пробу на мышах [6]. Несмотря на высокую надежность и чувствительность этих методов, они имеют ряд недостатков. Основным недостатком биологической пробы на мышах и выделения вируса в культуре клеток является то, что для получения результатов исследования может потребоваться длительное время [11]. Точность постановки диагноза методом РИФ во многом зависит от наличия у персонала диагностических лабораторий необходимой квалификации. Кроме этого, для проведения диагностики с использованием этих методов, как правило, не годятся пробы с признаками частичного разложения мозговой ткани, в силу возможного получения лож-ноотрицательных результатов. Эти диагностические системы также малопригодны для широкомасштабного мониторинга бешенства. Перечисленных выше недостатков метод имму-ноферментного анализа (ИФА) не имеет. Этот метод в числе других рекомендован для диагностики бешенства Всемирной Организацией Здравоохранения (В0З) и Всемирной Организацией Охраны Здоровья Животных (OIE) [5]. Иммуноферментный анализ отличается простотой и быстротой выполнения, может обходиться без применения дорогостоящего оборудования в случае визуальной оценки результатов исследований. Он отлично подходит для проведения мониторинга бешенства, при этом позволяя интерпретировать полученные результаты с высокой степенью достоверности.

Ранее нами был разработан твердофазный непрямой сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для диагностики бешенства животных, с использованием поликлональных антител, полученных на рибонуклеопротеин вируса бешенства [2]. Прямой сэндвич-вариант ИФА более быстрый по времени и менее затратный, чем непрямой.

Целью данной работы являлась разработка прямого сэндвич-варианта ИФА для диагностики бешенства и проведение сравнительных испытаний прямого и непрямого сэндвич-варианта ИФА.

Материалы и методы. Рибонуклеопротеин вируса бешенства (далее, РНП ВБ) выделяли из клеток ВНК-21, инфицированных вирусом бешенства (далее, ВБ), штамм ВНИИЗЖ, по методике, рекомендованной ВОЗ в руководстве «Лабораторная диагностика бешенства» [8]. Вирус бешенства, штамм ВНИИЗЖ, очищали и концентрировали из культурального вирусного сырья, инактивированного димером этиленимина [3]. Концентрацию белка в очищенных препаратах вируса и РНП вируса определяли по методу Лоури [9]. Степень чистоты полученных антигенов контролировали методом вертикального электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях.

В качестве улавливающих использовали поликлональ-ные антитела к РНП ВБ, которые получали иммунизацией кроликов соответствующим антигеном. Очищенный РНП ВБ вводили животным внутримышечно три раза (0, 40, 54 дни) в дозе 400 мкг на голову.

В качестве детекторных использовали антирабические антитела морской свинки, которые получали иммунизацией животных очищенным ВБ. Антиген вводили животным внутримышечно четырехкратно в дозе 200 мкг на голову с интервалами в 1 неделю, 5 и 2 недели. При иммунизации морских свинок и кроликов первую инъекцию проводили с полным, а последующие — с неполным адъювантом Фрейнда «Sigma».

Через две недели после последней инъекции в сыворотках крови иммунизированных животных определяли титры специфических антител методом твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа. Титровали с шагом три, начиная с разведения 1:1000. В дальнейшей работе использовали сыворотки крови с титрами антител к ВБ и РНП ВБ не ниже 1:243000. Из отобранных сывороток выделяли фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Поликлональные антирабические антитела морских свинок использовали для получения антирабического перокси-дазного коньюгата по методу Накане [4].

Для отмывки лунок планшетов от компонентов реакции использовали Трис-HCl буферный раствор с добавлением Tween-20 (ТБСТ).

В качестве субстрата для пероксидазы использовали ор-тофенилендиамин.

Для учета результатов непрямого сэндвич-варианта ИФА использовали антивидовой пероксидазный конъюгат к антителам морской свинки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (г. Москва) в разведении 1:1000.

Положительным контролем в ИФА служила инактивиро-ванная р-пропиолактоном [10] лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани кролика, инфицированного ВБ штамма CVS. В качестве отрицательного контроля использовалась лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани неинфицированного кролика.

Исследуемые образцы (пробы ткани головного мозга животных) поступали в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из разных региональных ветеринарных лабораторий. Поступивший биоматериал до использования хранили при минус 20°С. Образцы мозговой ткани для исследования готовили следующим образом. В пенициллиновый флакон с Трис — НС1 буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве, необходимом для приготовления 30%-ной суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 200С.

Кроме прямого сэндвич-варианта ИФА пробы исследовали методами РИФ [1] и непрямым сэндвич-вариантом ИФА [2]. При исследовании проб головного мозга в РИФ использовали ФИТЦ-иммуноглобулин производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Результаты и обсуждение. Исследования проб в прямом сэндвич-варианте ИФА выполняли по следующей схеме.

Сенсибилизация планшетов. Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили поликлональные кроличьи антитела к РНП ВБ по 100 мкл в лунку, разведенные в карбонатно-би-карбонатном буферном растворе (рН 9,5) до концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 ч при 4°С. Сенсибилизированный планшет 3 раза отмывали ТБСТ.

Внесение исследуемых проб и контрольных препаратов. В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор) контроли и исследуемые пробы по 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали 1 ч при 37°С и затем трижды отмывали промывочным буферным раствором.

Внесение пероксидазного антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического конъюгата с перокси-дазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5%-ной нормальной сыворотки лошади. В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного коньюгата, инкубировали 1 ч при 37°С и отмывали 5 раз промывочным буферным раствором. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата предварительно определяли в прямом сэндвич-варианте ИФА методом последовательных разведений, с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов, которое составило 1:1500.

Внесение субстрат-хроматогенной смеси. Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 3н H2SO4.

Учет результатов . Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра «BioRad PR 2100» при длине волны 490 нм. Определяли среднюю оптическую плотность (ОП) безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП (ОПр) отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их ОПр превышала ОПр отрицательного контроля на 0,1 единицы [5].

Для оценки диагностической специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных, отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная оптическая плотность отрицательных проб составила 0,013±0,0004, что свидетельствует о высокой специфичности разработанного ИФА, которая в данном исследовании составила 100%.

С целью измерения предела чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Проведенные исследования показали, что предел чувствительности метода находится в диапазоне 15-30 нг/мл. При этом предел чувствительности непрямого сэндвич-варианта ИФА, разработанного нами ранее [2], составил такую же величину.

Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич-вариантом ИФА в сравнении с другими методами, в том числе и непрямым сэндвич-вариантом ИФА, было исследовано 100 проб головного мозга животных, направленных в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для исследования на бешенство. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований мозговой ткани животных, подозреваемых в заболевании бешенством, в прямом сэндвич-варианте ИФА, в сравнении с другими методами диагностики бешенства

Положительным контролем в ИФА служила инактивиро-ванная р-пропиолактоном [10] лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани кролика, инфицированного ВБ штамма CVS. В качестве отрицательного контроля использовалась лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани неинфицированного кролика.

Бешенство – это крайне опасное вирусное заболевание, характеризующееся тяжелым поражением головного и спинного мозга. Оно часто заканчивается летальным исходом.

Бешенство встречается у всех млекопитающих и передается с биологическими жидкостями, в основном со слюной. Человек, как правило, заражается им в результате укуса инфицированного животного, чаще всего собаки, кошки, кролика, хорька, лисицы, волка, енота, летучей мыши и др.

На начальном этапе заболевание проявляется усиленным слюноотделением и боязнью воды, а также угнетенным состоянием, которое сменяется приступами агрессии и возбуждения.

Людям, входящим в группу риска развития бешенства, необходимо проходить вакцинацию.

К сожалению, появление симптомов заболевания неизбежно заканчивается летальным исходом, так что лечение предполагает лишь облегчение состояния больного.

Рабиес, гидрофобия, водобоязнь.

Rabies, Hydrophobia, Canine madness, Lyssa, Madnessan.

Обычно бешенство не вызывает никаких симптомов вплоть до последней стадии заболевания, когда лечение уже невозможно. Инкубационный период (от заражения до появления симптомов) составляет от 7 дней до 1 года, в среднем 20-90 дней. Признаки заболевания часто появляются за несколько дней до смерти больного:

• перед появлением основных симптомов на месте укуса может возникать припухлость, покраснение, зуд,
• лихорадка,
• головная боль, недомогание,
• потеря аппетита, тошнота, рвота, понос,
• беспокойство, нарушения сна,
• депрессия,
• повышенная чувствительность к слуховым, зрительным раздражителям,
• угнетенное состояние сознания, тревожность, апатия сменяются приступами возбуждения, беспокойства, агрессии. Приступы возбуждения при этом сопровождаются учащением дыхания и сердцебиения,
• расстройства дыхания и глотания,
• гидрофобия – боязнь воды (при разговоре о ней или при попытке попить больной испытывает ужас, у него возникают болезненные спазмы глотки и гортани),
• чрезмерное слюноотделение,
• галлюцинации,
• судороги,
• частичный паралич.

Общая информация о заболевании

Бешенство – это опасное вирусное заболевание, которое характеризуется тяжелым поражением центральной нервной системы (головного и спинного мозга). На начальном этапе оно протекает бессимптомно, симптомы появляются на поздней стадии, когда лечение уже невозможно.

Распространенность бешенства зависит от степени вакцинированности домашних животных. Наиболее распространено оно в сельской местности и чаще возникает в летний период.

Бешенство может поражать всех млекопитающих и передается с биологическими жидкостями, в основном со слюной. У человека заражение бешенством, как правило, происходит в результате укуса зараженным животным, попадания слюны зараженного животного на поврежденную кожу, слизистую оболочку рта, носа, глаз. Значительно реже бешенство передается при употреблении инфицированного мяса. От человека к человеку заболевание не переходит, крайне редко может встречаться заражение через пересадку органов от инфицированных доноров.

Чаще всего человек заражается от домашних животных – от собак, кошек, кроликов, лошадей, хорьков, реже – от диких – лисиц, енотовидных собак, волков, енотов, летучих мышей и др. Дикие животные, в свою очередь, заражают бешенством домашних.

После того как вирус попадает в организм через кожу или слизистую оболочку, он по нервным волокнам достигает спинного и головного мозга, где фиксируется и начинает делиться. Возникает энцефалит – воспаление головного мозга. Это приводит к повышению рефлекторной возбудимости и к развитию параличей. Затем вирус распространяется по нервным волокнам в обратном направлении, попадая в печень, почки, надпочечники, кожу, сердце, слюнные железы, скелет, вызывая нарушение деятельности нервной системы и нарушение функций различных органов.

Скорость распространения вируса зависит от расположения укуса (при укусах головы, рук она будет высокой), его глубины, от количества возбудителей, попавших в рану, от активности микроорганизмов, от иммунного статуса инфицированного человека.

Инкубационный период заболевания в среднем составляет 20-90 дней, однако может варьироваться от недели до одного года. При появлении симптомов летальный исход, как правило, неизбежен.

Смерть обычно наступает в результате поражения дыхательного центра, что влечет за собой остановку дыхания.

Кто в группе риска?

• Подвергшиеся укусам домашних или диких животных.
• Жители сельской местности, держащие дома животных, не вакцинированных от бешенства.
• Путешествующие по развивающимся странам (по Африке, Юго-Восточной Азии).
• Выезжающие на природу и контактирующие с дикими животными (лисицами, енотами, летучими мышами и др.)
• Охотники, звероловы.
• Служащие зоопарков, питомников, приютов для животных.
• Ветеринары.
• Работающие с вирусом бешенства в лаборатории.

Диагноз «бешенство» предполагается при наличии симптомов заболевания после укуса животного и подтверждается исследованием образца кожи с затылка, выделением вируса из слюны, слезной и спинномозговой жидкости.

• Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ). Уровень лейкоцитов может быть повышен.
• Общий анализ мочи. При бешенстве может отмечаться значительное увеличение числа лейкоцитов в моче в отсутствие бактериального воспаления.
• Исследование крови, направленное на определение антител к возбудителю бешенства. В ходе анализа с помощью специального иммунофлюоресцентного окрашивания выявляется наличие в крови молекул, вырабатываемых иммунной системой в ответ на попадание в организм вируса бешенства. Диагноз подтверждается при значительном (4 и более раза) повышении количества (титра) антител к вирусу бешенства у больных, которые не подвергались вакцинации.

• Определение возбудителя бешенства в биологических жидкостях и тканях организма.
  • Исследование биоптатов (фрагментов тканей) кожи затылка, отпечатков роговицы. В полученный материал добавляются меченые антитела (молекулы, специфически связывающиеся с молекулой вируса бешенства). Под воздействием ультрафиолетового излучения комплекс из вирусов, «склеенных» с антителами, дает характерное зеленоватое свечение, что говорит о присутствии вируса бешенства во взятом материале. Данный анализ является наиболее достоверным в течение первой недели заболевания.
  • Исследование генетического материала вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Может использоваться слюна, кровь, спинномозговая жидкость, а также пораженные ткани. Достоверность результатов приближается к 100&nbs

    Подписка на новости

    Оставьте ваш E-mail и получайте новости, а также эксклюзивные предложения от лаборатории KDLmed

    • Подвергшиеся укусам домашних или диких животных.
    • Жители сельской местности, держащие дома животных, не вакцинированных от бешенства.
    • Путешествующие по развивающимся странам (по Африке, Юго-Восточной Азии).
    • Выезжающие на природу и контактирующие с дикими животными (лисицами, енотами, летучими мышами и др.)
    • Охотники, звероловы.
    • Служащие зоопарков, питомников, приютов для животных.
    • Ветеринары.
    • Работающие с вирусом бешенства в лаборатории.

    Заболевание бешенство у людей: механизм передачи и лечение

    Бешенство является одним из наиболее опасных и тяжелых инфекционных заболеваний вирусной этиологии. Возбудитель бешенства (вирус Neuroiyctes rabid) вызывает тяжелые и необратимые поражения центральной нервной системы. Вирус проявляет устойчивость к антибиотикам, воздействию низких температур, зато разрушается при прогревании и взаимодействии с щелочами. Большинство случаев заражения оканчиваются смертельным исходом.

    Различают бешенство природного типа, механизм передачи которого связан с активностью диких животных (летучих мышей, волков, лисиц, скунсов, енотовидных собак и др.) и городской тип заболевания (животные, задействованные в сельском хозяйстве, кошки, собаки). Наибольшая смертность приходится на процент людей, инфицированных в результате укусов бродячих или домашних собак.

    Заражение бешенством происходит посредством укуса животного или попадания на открытую рану его инфицированной слюны. После внедрения вируса он с большой скоростью распространяется по всем сообщениям и системам организма человека. По нервным стволам он проникает в центральную и периферийную нервную систему, поражая все ее отделы. Характеристика вируса свидетельствует о том, что он распространяется также гематогенным и лимфогенным путем.

    «Животные — главный источник бешенства»

    Инкубационный период данного недуга составляет приблизительно 1-2 месяца (в редких случаях доходит до года). Срок зависит от места повреждения, его удаленности от мозга пациента, количества молекул вируса, попавших в рану. Из травмированной области вирус бешенства попадает в мозговое вещество, где вызывает энцефалит. Скорость перемещения вируса по нервным волокнам – 3 мм/час.

    Различают три стадии бешенства у человека. Каждая из них характеризуется специфическими симптомами.

    Начальный или продромальный период

    Его продолжительность составляет от 24 часов до 3 суток. Характерны такие симптомы:

    • Первые сигналы поступают со стороны раны. Если к данному моменту место укуса животного уже успело зарубцеваться, то пациент все равно чувствует жжение или зуд. Эпидермис воспаляется;
    • Появляется температура субфибрильного характера (37-37,3°С). Выше заданной отметки она пока не колеблется;
    • Присоединяются признаки общего недомогания – головная боль, слабость, тошнота, переходящая в рвоту;
    • Часто укус приходится на область лица. В этом случае болезнь проявляет себя различными психологическими отклонениями. Возникают зрительные или обонятельные галлюцинации. Больного преследуют несуществующие образы, запахи. Резкая смена настроения вызывает депрессивное состояние, замкнутость или, наоборот, агрессию, тревожность;
    • Отсутствие аппетита, нарушения сна. Ночные кошмары способствуют появлению бессонницы.

    Стадия возбуждения

    На этом этапе происходит активное распространение вируса по всем системам человека. Продолжительность его колеблется от 2 до 3 суток. Типичными считаются следующие симптомы:

    1. Характерный признак прогрессирования заболевания – гидрофобия при бешенстве. При желании сделать глоток жидкости у пострадавшего возникает неконтролируемый спазм глотательных и дыхательных мышц. Их сжатие настолько сильное, что могут возникать рвотные позывы.
    2. Состояние больного характеризуется повышенной чувствительностью к громким звукам, яркому свету и другим внешним раздражителям. Их действие вызывает агрессию, галлюцинации, сильное возбуждение, бред. Периодически могут возникать приступы, во время пика которых у человека на несколько секунд прекращается сердцебиение, отсутствует дыхание. Как только приступ бешенства проходит, пациент снова становится адекватным, речь его понята окружающим.
    3. Пульс инфицированного во время панической атаки учащается, из ротовой полости обильно вытекает слюна.
    4. Возникают судороги. Они затрагивают, в первую очередь, лицевые мышцы.
    5. Температура тела повышается даже до 40°С.

    Стадия параличей

    На данной стадии заболевание полностью охватывает весь человеческий организм. Ее продолжительность составляет не более суток. Судороги и галлюцинации перестают беспокоить больного, он выглядит спокойным, что часто воспринимается окружающими как прогресс выздоровления. Через короткое время происходит значительный и резкий скачок температуры до 42°С. Артериальное давление при этом опускается ниже критической отметки, сердцебиение ускоряется. Летальный исход возникает вследствие паралича миокарда или дыхательного центра.

    В большинстве клинических случаев весь цикл болезни инфицированного человека длится от 3 до 7 дней. Иногда смерть от бешенства происходит в первые сутки заражения, когда клиническая картина размыта, а заболевание стремительно прогрессирует.

    Диагностика

    Как показывает практика, лабораторная диагностика данного вируса у человека при жизни практически неосуществима. Анализ на бешенство чаще всего осуществляется на основе клинических симптомов. К ним относятся:

    • факт укуса или попадания на кожу человека слюны потенциально опасного животного;
    • болевые ощущения в месте укуса даже после полного заживления мягких тканей;
    • гидрофобия, светобоязнь;
    • спазмы основных групп мышц;
    • паралич;
    • нарушение дыхательной функции, глотания.

    Анализ крови при бешенстве у человека позволяет выявить повышенное содержание лейкоцитов, аномально высокий уровень гемоглобина и количество эритроцитов. Исследование биоматериала крови также зафиксирует повышение гематокрита.

    Высокоточным и высокочувствительным методом прижизненной диагностики бешенства считается ИФА-исследование кожного участка шеи, взятого методом биопсии (по линии роста волос). Метод позволяет достоверно и быстро определить антиген вируса бешенства, который локализуется в нервных окончаниях, прилегающих к волосяным фолликулам.

    Заболевание неизлечимо в том случае, если проявились его характерные признаки. Снизить дозу попавшего в организм вируса может постэкспозиционная профилактика (или ПЭП).

    Ее основная цель – правильное и своевременное оказание первой помощи человеку, который пострадал от укуса или контакта, несущего угрозу инфицирования бешенством. Данные меры предотвратят проникновение вируса в клетки центральной нервной системы, которое обычно неминуемо приводит к гибели человека. Экстренная профилактика состоит из следующих операций:

    1. Обильная дезинфекция (промывание) и местная обработка места укуса. Манипуляции должны быть произведены сразу же после контакта! Используют воду с мылом, йодсодержащие растворы.
    2. Экстренное усиление иммунной защиты с помощью мощной и эффективной противовирусной вакцины, которая соответствует современным стандартам ВОЗ.
    3. Введение АИГ (антирабического иммуноглобулина). Выполняют только в случае наличия определенных показаний.

    Антитела к вирусу появятся в организме не ранее, чем через 2 недели после введения первой прививки. А наибольшее их количество будет отмечено через месяц после прививания. Если существует даже малый риск сокращения бессимптомного периода, то пациенту вводят АИГ. Как только курс будет завершен, иммунная система пострадавшего активизируется и начнет работу.

    Проводится также интенсивное симптоматическое лечение. Больному в период проявления явных признаков бешенства прописывают лекарства для снятия болевых ощущений, сердечные стимуляторы, снотворные и успокоительные препараты. На последних стадиях возникает необходимость подключения к аппарату искусственной вентиляции легких.

    Несмотря на разработанные по новейшим технологиям препараты и таблетки от бешенства для людей, пострадавшие продолжают погибать от страшного вируса. Медики уверены, что в этом виновата беспечность людей и их недостаточная осведомленность об опасности заболевания.

    В период лечения больному запрещены любые алкогольные напитки, переохлаждение, пребывание в условиях повышенных температур (на открытом солнце, в бане). Крайне нежелательны тяжелые физические нагрузки. Все эти факторы связаны со снижением скорости выработки антител, падением защитных сил организма.

    Профилактика

    Мерами, которые предупреждают бешенство домашних животных, являются:

    • соблюдение установленных правил содержания собак, их регистрация, выгул в наморднике, содержание в вольерах;
    • обязательная (принудительная) вакцинация против бешенства, которая проводится один раз в год.

    Профилактическая иммунная терапия показана лицам, профессиональная деятельность которых связана с дикими или домашними животными (охотники, ветеринарные врачи, работники служб отлова животных).

    Если вас все-таки укусило уличное или домашнее животное, состояние здоровья которого вам неизвестно, следует принять следующие профилактические меры:

    1. промыть рану теплым раствором с хозяйственным мылом.
    2. обработать края поврежденных мягких тканей аптечным спиртом.
    3. наложить свободную повязку и обратиться за квалифицированной помощью.

    В травмпункте врач примет решение, нужна ли пациенту вакцинация. Ее выполнение обязательно в следующих случаях:

    • попадание слюны животного на слизистые оболочки человека;
    • укусы любой тяжести и глубины, которые приходятся на область головы, лица, рук;
    • глубокие или множественные укусы домашнего животного;
    • любые травмы или повреждения, нанесенные диким животным (в том числе и ослюнение).

    «Животные — главный источник бешенства»

    Экспресс-диагностика бешенства

    Методы выявления антигенов. При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

    Определение антител к антигенам вируса бешенства. Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости — важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

    Выделение вируса. Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

    Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода — необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

    Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

    Выделение и идентификация вируса на культуре клеток. Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

    Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

    Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

    Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

    Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

    а) метод МФА — для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
    б) метод ПЦР — для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
    в) метод ИФА — для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
    г) метод биопробы — для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

    Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

    Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

    Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

    Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью — менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

    Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

    Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

    В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

    Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

    При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

    Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

    Иммуноферментный анализ. Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

    Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке — А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

    Иммуноферментные методы — весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

    Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

    Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

    Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

    Метод полимеразной цепной реакции. Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР — самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

    ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

    Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

    Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

    В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР — высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

    Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

    Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве — это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

    Выделение вируса. Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

    Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

    
    Меры личной профилактики

    Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

    По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

    Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

    Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

    Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.