Индикация Ринотрахеит Кошек Пцр

2.3 Этапы лабораторной диагностики

Индикация вируса осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунной флуоресценции (РИФ).

Реакция иммунной флуоресценции (РИФ).

Сэндвич вариант: К антигену добавляют антитела, образуется комплекс антиген-антитело к нему добавляют специфический конъюгат, после чего образуется комплекс-специфический конъюгат к которому добавляют субстрат.

Непрямой вариант: АТ+АГ образуется комплекс АТ-АГ к которому добавляют антивидовой конъюгат в результате образуется комплекс-антивидовой конъюгат к которому добавляют субстрат.

РИФ, предложенную Кунсом еще в 1942 году, трудно отнести к новым методам исследования. Но благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела, РИФ получила в настоящее время вторую жизнь, ее чувствительность и специфичность значительно увеличены.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего она используется для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала как для обычной микроскопии готовят мазок на предметном стекле. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченые ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой РИФ сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе (антивидовыми)). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован помимо обнаружения антигена и для обнаружения антител. В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязанные антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов (антивидовой). В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Рис. 2 РИФ при диагностике FHV-1: а). Клетки, инфицированные вирусом FHV-1; б). Скопление клеточных мембран инфицированных клеток.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ПЦР диагностика — предпочтительный метод диагностики герпес-вирусной инфекции на острой стадии, основанный на выделении ДНК FHV из смывов с конюънктивы, носоглотки, соскобов с роговицы.

Важным этапом в совершенствовании методов диагностики инфекционных заболеваний явилась разработка методов, позволяющих обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Создание принципиально нового способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые возможности для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мюллисом. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки — олигонуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидных пар (праймеры). Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n — число циклов амплификации. Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации (состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и построения фрагмента). В результате 30-35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагментов, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном гелях. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.

Метод ПЦР превосходит метод выделения вируса на культурах клеток, особенно в случае бактериальной контаминации, которая мешает традиционной технике культивирования; более чувствителен и менее трудоемок.

Наличие вторичной бактериальной и грибковой инфекции может осложнять и маскировать первичную вирусную инфекцию, затрудняя клиническую диагностику. Таким образом, существенным является возможность определения вирусных протеинов или вирусной ДНК для подтверждения диагноза первичной вирусной инфекции. ПЦР может являться одним из методов подтверждения FHV-1 инфекции в гистологических образцах в подозрительных случаях.

К сожалению, диагностика FHV-1 инфекции с помощью ПЦР-амплификации имеет ограниченную клиническую ценность, поскольку могут выявляться латентные инфекции, широко распространенные у кошек, таким образом, невозможно будет определить, играет ли FHV-1 первичную роль в возникновении заболевания, или же он просто реактивировался из латентного состояния под действием стресса или сопутствующей инфекции. Немалую роль в ограничении использования ПЦР является дороговизна оборудования и реактивов, высокая требовательность к качеству реактивов, строжайшие требования к помещениям и организации работы в ПЦР-лаборатории для исключения контаминации образцов продуктами амплификации.

Выделение вируса на культуре клеток.

В 1958 году CrandellandMaurer продемонстрировали, что вирус FHV-1 растет и вызывает цитопатический эффект в культуре клеток почки кошки, что позволило создать invitro систему для выделения и изучения свойств FHV-1.

Для выделения вируса FHV-1 мазок берут с поверхности конъюнктивы или слизистой оболочки ротоглотки, обычно используют стерильные тампоны из хлопка или дакрона. Сразу после взятия пробы тампон помещают в пробирку с 1-1,5 мл вирусной транспортной среды с антибиотиками. При необходимости пробы замораживают и сохраняют при -70оС. Для выделения вируса обычно используют культуру клеток почки кошки CrFK, выращенную на плашках (рис. 3).

Рис. 3. Перевиваемая культура клеток почки кошки — CrFK.

Зараженную культуру клеток инкубируют при 37оС и 5% СО2 в течение 10 дней, просматривая каждые 24-48 часов для обнаружения признаков цитопатического действия вируса ВРТ кошек (рис. 4.)

Рис. 4. Цитопатическое действие вируса FHV-1, штамм «Гранд» на культуру клеток CrFK: а). ЦПД вируса через 48ч после инокуляции, б). ЦПД вируса через 72 ч после инокуляции.

Для подтверждения и идентификации выделенного изолята вируса FHV-1 используют метод иммунофлюоресценции со специфической антисывороткой, а также электронную микроскопию.

Основными недостатками метода выделения вируса на культурах клеток являются: длительность (до 10 дней), высокая трудоемкость, сложность, высокая стоимость, невозможность выделения вируса в случае бактериальной контаминации образцов.

Вероятно, что незрелый, необладающий достаточной инфекционностью вирус, продуцируемый на некоторых стадиях FHV-1-инфекции, ограничивает чувствительность традиционного метода выделения вируса. В дополнение к этому разрушение оболочек вирионов при транспортировке, связывание вируса антителами (образование комплекса вирус-антитело) на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек также в некоторых случаях являются возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток.

Идентификация выделенного вируса проводят методами ПЦР и реакцией нейтрализации (РН).

Ретроспективная диагностика. Иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА — специфичный и универсальный метод, отличающийся высокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов. В ИФА первый известный компонент (антитело или антиген) сорбируют на твердую фазу. Следующие компоненты, включая исследуемые пробы, вносят последовательно в жидком растворенном виде. Сформировавшиеся после инкубации иммунные комплексы антиген-антитело отделяют от непрореагировавших компонентов реакции при отмывании планшет. В ИФА используют противовирусные или антивидовые антитела, меченые пероксидазой хрена (ПХ) или другими ферментами, которые затем выявляются различными субстратами (диаминобензидин, 5-аминосалициловая кислота, о-фенилендиамин). Изменение цвета регистрируется визуально или спектрофотометрически, что дает возможность проводить количественный учет результатов анализа.

Разработаны различные варианты ИФА: прямые, непрямые, методы блокирования и конкурентные. В прямых вариантах используют меченые ферментом противовирусные антитела, в непрямых — антивидовыеконъюгаты. В конкурентном варианте и методе блокирования типирование и титрование исследуемых антигенов и антител обеспечивается за счет вытеснения с их помощью определенного количества меченого антигена или антитела.

Для обнаружения антител к FHV-1 ИФА ставят на многолуночныхмикротитровальных плашках, сенсибилизированных антигеном FHV-1 по стандартной методике. Используют как моноклональные антитела, так и поликлональные анти-кошачьи IgG, в качестве ферментной метки чаще всего используют пероксидазу хрена. Определения показателя абсорбции проводят на автоматическом ИФА-ридере с фильтром 492 нм.

ИФА — универсальный, и на сегодняшний день наиболее чувствительный и совершенный метод определения антител к FHV-1 у кошек.

Наличие вторичной бактериальной и грибковой инфекции может осложнять и маскировать первичную вирусную инфекцию, затрудняя клиническую диагностику. Таким образом, существенным является возможность определения вирусных протеинов или вирусной ДНК для подтверждения диагноза первичной вирусной инфекции. ПЦР может являться одним из методов подтверждения FHV-1 инфекции в гистологических образцах в подозрительных случаях.

Лечебная эффективность ацикловира при ринотрахеите кошек

Представлены результаты, подтверждающие терапевтическую эффективность ацикловира при ринотрахеите кошек.

Представлены результаты, подтверждающие терапевтическую эффективность ацикловира при ринотрахеите кошек

В последние годы среди населения отмечается повышенный интерес к приобретению кошек различных экзотических пород, сопровождающийся увеличением количества частных питомников, специализирующихся на разведении этих животных. Чаще всего такие питомники размещаются в условиях обычных квартир, непредназначенных для содержания в них большого количества животных.

Повышение концентрации животных на небольшой территории оказывает влияние на распространение инфекционных заболеваний, в частности ринотрахеита кошек, способствует постоянному многократному пассированию возбудителя на восприимчивых животных и повышению его инфекционной активности, что ведет к обострению инфекционного процесса.

При данной патологии большую роль играет специфическая профилактика, поскольку иммунизированные животные легче переносят инфекцию или становятся невосприимчивыми к заражению.

В последние годы для профилактики ринотрахеита кошек в большинстве частных питомников широко применяют аттенуированные (живые) «Квадрикат», «Нобивак Tricat» и инактивированную: «Мультифел 4» вакцины.

Не смотря на проводимую профилактическую иммунизацию, у животных частных питомников время от времени наблюдаются острые вспышки заболевания, периодическое обострение латентной инфекции в результате воздействия на организм различных стрессовых и других факторов. При этом у кошек часто регистрируют эндометриты, приводящие к бесплодию, а также риниты, трахеиты и кератоконъюнктивиты.

Применение эффективных противовирусных препаратов особенно важно во время острых вспышек заболевания, охватывающих от 50 до 80% восприимчивых животных в питомниках по разведению кошек.

Установлена высокая терапевтическая эффективность противовирусных препаратов фоспренил и максидин при лечении различных клинических форм ринотрахеита кошек. В условиях in vitro определена противовирусная активность ацикловира в отношении вируса ринотрахеита кошек. Однако нет сведений о результатах изучения терапевтической эффективности этого препарата, проведенных in vivo.

Целью работы являлось изучение лечебной эффективности ацикловира при острой вспышке ринотрахеита кошек, которая отмечалась у 12 котят 1 – 6-месячного возраста в питомнике по разведению персидских кошек, проявлялась в виде отказа от корма, слюнотечения, чихания, серозного ринита и конъюнктивита, повышения температуры тела до 40–40,5 0 С.

В своих исследованиях использовали коммерческую тест-систему для диагностики ринотрахеита кошек «Риновир», разработанную ФГУ «ВГНКИ» совместно с центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.

Во всех пробах носовых выделений и истечений из глаз, отобранных от животных в разгар острой вспышки заболевания, методом ПЦР был выявлен вирус ринотрахеита кошек.

Были сформированы опытная и контрольная группы животных, по 6 голов в каждой. Животным опытной группы с лечебной целью давали ацикловир 3 раза в день в течение 7 дней в дозе 3-3,5 мг/кг массы тела. Контрольным животным вводили, широко используемый в последнее время во многих ветеринарных клиниках и рекомендованный для этих целей противовирусный препарат – фоспренил в дозах, рекомендованных разработчиками.

От животных опытной и контрольной групп перед началом терапии, затем дважды с интервалом в 7 суток отбирали пробы крови для проведения гематологических и биохимических исследований, ежедневно – пробы носовых выделений для индикации возбудителя в них.

Эффективность применения препарата ацикловир оценивали по сокращению сроков выявления клинических признаков заболевания и вируса в пробах биоматериала, отобранного от опытных и контрольных животных.

В результате проведенных исследований у животных опытной группы установили клиническое выздоровление (отсутствие носовых выделений, кашля, чихания, повышение активности и аппетита, нормализация температуры тела) на 5-7 сутки наблюдения. У трех опытных животных уже на вторые сутки отмечали снижение температуры тела. Сроки выявление вируса в носовых выделениях составляли 7-9 суток.

В контрольной группе животных исчезновение клинических признаков заболевания отмечали на 9-12 сутки, выявление вируса в пробах биоматериала отмечали на протяжении 10-14 суток.

Таким образом, ацикловир обладает высокой эффективностью при лечении ринотрахеита кошек, способствует сокращению сроков клинического выздоровления животных и выделения вируса с носовыми секретами.

В своих исследованиях использовали коммерческую тест-систему для диагностики ринотрахеита кошек «Риновир», разработанную ФГУ «ВГНКИ» совместно с центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.

Индикация Ринотрахеит Кошек Пцр

Паренхиматозные органы и лимфоузлы.

Этапы лабораторной диагностики

Индикация вируса осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунной флуоресценции (РИФ).

Реакция иммунной флуоресценции (РИФ).

Сэндвич вариант: К антигену добавляют антитела, образуется комплекс антиген-антитело к нему добавляют специфический конъюгат, после чего образуется комплекс-специфический конъюгат к которому добавляют субстрат.

Непрямой вариант: АТ+АГ образуется комплекс АТ-АГ к которому добавляют антивидовой конъюгат в результате образуется комплекс-антивидовой конъюгат к которому добавляют субстрат.

РИФ, предложенную Кунсом еще в 1942 году, трудно отнести к новым методам исследования. Но благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела, РИФ получила в настоящее время вторую жизнь, ее чувствительность и специфичность значительно увеличены.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего она используется для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала как для обычной микроскопии готовят мазок на предметном стекле. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченые ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой РИФ сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе (антивидовыми)). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован помимо обнаружения антигена и для обнаружения антител. В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязанные антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов (антивидовой). В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Рис. 2 РИФ при диагностике FHV-1: а). Клетки, инфицированные вирусом FHV-1; б). Скопление клеточных мембран инфицированных клеток.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ПЦР диагностика — предпочтительный метод диагностики герпес-вирусной инфекции на острой стадии, основанный на выделении ДНК FHV из смывов с конюънктивы, носоглотки, соскобов с роговицы.

Важным этапом в совершенствовании методов диагностики инфекционных заболеваний явилась разработка методов, позволяющих обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Создание принципиально нового способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые возможности для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мюллисом. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки — олигонуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидных пар (праймеры). Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n — число циклов амплификации. Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации (состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и построения фрагмента). В результате 30-35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагментов, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном гелях. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.

Метод ПЦР превосходит метод выделения вируса на культурах клеток, особенно в случае бактериальной контаминации, которая мешает традиционной технике культивирования; более чувствителен и менее трудоемок.

Наличие вторичной бактериальной и грибковой инфекции может осложнять и маскировать первичную вирусную инфекцию, затрудняя клиническую диагностику. Таким образом, существенным является возможность определения вирусных протеинов или вирусной ДНК для подтверждения диагноза первичной вирусной инфекции. ПЦР может являться одним из методов подтверждения FHV-1 инфекции в гистологических образцах в подозрительных случаях.

К сожалению, диагностика FHV-1 инфекции с помощью ПЦР-амплификации имеет ограниченную клиническую ценность, поскольку могут выявляться латентные инфекции, широко распространенные у кошек, таким образом, невозможно будет определить, играет ли FHV-1 первичную роль в возникновении заболевания, или же он просто реактивировался из латентного состояния под действием стресса или сопутствующей инфекции. Немалую роль в ограничении использования ПЦР является дороговизна оборудования и реактивов, высокая требовательность к качеству реактивов, строжайшие требования к помещениям и организации работы в ПЦР-лаборатории для исключения контаминации образцов продуктами амплификации.

Выделение вируса на культуре клеток.

В 1958 году CrandellandMaurer продемонстрировали, что вирус FHV-1 растет и вызывает цитопатический эффект в культуре клеток почки кошки, что позволило создать invitro систему для выделения и изучения свойств FHV-1.

Для выделения вируса FHV-1 мазок берут с поверхности конъюнктивы или слизистой оболочки ротоглотки, обычно используют стерильные тампоны из хлопка или дакрона. Сразу после взятия пробы тампон помещают в пробирку с 1-1,5 мл вирусной транспортной среды с антибиотиками. При необходимости пробы замораживают и сохраняют при -70оС. Для выделения вируса обычно используют культуру клеток почки кошки CrFK, выращенную на плашках (рис. 3).

Рис. 3. Перевиваемая культура клеток почки кошки — CrFK.

Зараженную культуру клеток инкубируют при 37оС и 5% СО2 в течение 10 дней, просматривая каждые 24-48 часов для обнаружения признаков цитопатического действия вируса ВРТ кошек (рис. 4.)

Рис. 4. Цитопатическое действие вируса FHV-1, штамм «Гранд» на культуру клеток CrFK: а). ЦПД вируса через 48ч после инокуляции, б). ЦПД вируса через 72 ч после инокуляции.

Для подтверждения и идентификации выделенного изолята вируса FHV-1 используют метод иммунофлюоресценции со специфической антисывороткой, а также электронную микроскопию.

Основными недостатками метода выделения вируса на культурах клеток являются: длительность (до 10 дней), высокая трудоемкость, сложность, высокая стоимость, невозможность выделения вируса в случае бактериальной контаминации образцов.

Вероятно, что незрелый, необладающий достаточной инфекционностью вирус, продуцируемый на некоторых стадиях FHV-1-инфекции, ограничивает чувствительность традиционного метода выделения вируса. В дополнение к этому разрушение оболочек вирионов при транспортировке, связывание вируса антителами (образование комплекса вирус-антитело) на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек также в некоторых случаях являются возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток.

Идентификация выделенного вируса проводят методами ПЦР и реакцией нейтрализации (РН).

Ретроспективная диагностика. Иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА — специфичный и универсальный метод, отличающийся высокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов. В ИФА первый известный компонент (антитело или антиген) сорбируют на твердую фазу. Следующие компоненты, включая исследуемые пробы, вносят последовательно в жидком растворенном виде. Сформировавшиеся после инкубации иммунные комплексы антиген-антитело отделяют от непрореагировавших компонентов реакции при отмывании планшет. В ИФА используют противовирусные или антивидовые антитела, меченые пероксидазой хрена (ПХ) или другими ферментами, которые затем выявляются различными субстратами (диаминобензидин, 5-аминосалициловая кислота, о-фенилендиамин). Изменение цвета регистрируется визуально или спектрофотометрически, что дает возможность проводить количественный учет результатов анализа.

Разработаны различные варианты ИФА: прямые, непрямые, методы блокирования и конкурентные. В прямых вариантах используют меченые ферментом противовирусные антитела, в непрямых — антивидовыеконъюгаты. В конкурентном варианте и методе блокирования типирование и титрование исследуемых антигенов и антител обеспечивается за счет вытеснения с их помощью определенного количества меченого антигена или антитела.

Для обнаружения антител к FHV-1 ИФА ставят на многолуночныхмикротитровальных плашках, сенсибилизированных антигеном FHV-1 по стандартной методике. Используют как моноклональные антитела, так и поликлональные анти-кошачьи IgG, в качестве ферментной метки чаще всего используют пероксидазу хрена. Определения показателя абсорбции проводят на автоматическом ИФА-ридере с фильтром 492 нм.

ИФА — универсальный, и на сегодняшний день наиболее чувствительный и совершенный метод определения антител к FHV-1 у кошек.

Вероятно, что незрелый, необладающий достаточной инфекционностью вирус, продуцируемый на некоторых стадиях FHV-1-инфекции, ограничивает чувствительность традиционного метода выделения вируса. В дополнение к этому разрушение оболочек вирионов при транспортировке, связывание вируса антителами (образование комплекса вирус-антитело) на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек также в некоторых случаях являются возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток.

Вирусный ринотрахеит кошек (FHV-1) (ПЦР)

Цель исследования: качественный анализ для выявления ДНК вируса ринотрахеита кошек (Feline herpes virus)
Герпесвирус кошек (FHV), возбудитель вирусного ринотрахеита кошек, распространен – повсеместно. Описан только один серотип, однако вируленность отдельных штаммов вируса может отличаться.

В клетках кошки FHV реплицируется (размножается) в эпителиальных клетках конъюнктивы и верхних дыхательных путей, в нейронах. Инфицирование нейронов объясняет пожизненное вирусоносительство после первичного инфицирования.

Домашние кошки – основной хозяин FHV, но этот вирус также был выделен от гепардов и львов.

Опасность для человеческого здоровья: нет фактов, подтверждающих восприимчивость к данной инфекции человека

Устойчивость герпес-вируса во внешней среде: при 4⁰С сохраняется около 5 мес, при 25⁰С – около 1 месяца
вирус инактивируется за 3 часа при 37⁰С и за 5 мин при 56⁰С, чувствителен к большинству коммерческих дезинфектантов, антисептиков и детергентов.

Передача инфекции:
Передача через объекты окружающей среды – не является источником распространения, если речь не идет о совместном содержании кошек в группах более 4-5 особей (питомники/приюты).

Основной источник инфекции: кошки в острой стадии и носители в стадии обострения клинических симптомов. Трансплацентарная передача потомству – отсутствует. Восприимчивость котят раннего возраста к инфекции зависит от уровня материнских антител.

Виды течения герпес-вирусной инфекции:

Острая стадия заканчивается через 10-14 дней после инфицирования, при этом выделение вируса через слизистую глаз и носа начинается через 24 часа после инфицирования и длится 1-3 недели. Классическая острая форма – поражение слизистых оболочек в виде ринитов, конъюнктивитов, изъязвление роговицы.Наиболее тяжелое течение отмечается у котят.
Начальные симптомы: саливация, слезотечение, кашель, подъем температуры, отказ от корма, депрессия; серозные или серозно-геморрагические истечения из глаз/носа, гиперемия конюънктивы.

Аборты, в отличие от герпес вирусной инфекции у других видов животных, для кошек не типичны.

Хроническая стадия характерна для некоторых переболевших кошек и характеризуется более глубоким вовлечением в патологический процесс верхних дыхательных путей и тканей глаза и развитием иммуно-опосредованных поражений в них (стромальный кератит, хронический риносинусит).
Переход в латентную форму инфекции после острой фазы объясняется проникновением вируса по сенсорным нервам в нейроны (особенно в тройничный ганглий), и характеризуется периодической реактивацией вируса с выделением во внешнюю среду через слизистые. Практически все кошки, перенесшие острую фазу, становятся пожизненными латентными вирусоносителями. Выделение вируса можно инициировать примерно в 70 % случаев с помощью лечения глюкокортикоидами. Другими факторами, индуцирующими повышение секреции эндогенного кортизола и реактивацию инфекции, будут лактация (40 %) и переезд в новое помещение (18 %)
Лабораторная диагностика герпес-вирусной инфекции:

ПЦР диагностика – предпочтительный метод диагностики герпес-вирусной инфекции на острой стадии, основанный на выделении ДНК FHV из смывов с конюънктивы, носоглотки, соскобов с роговицы.
Не существует никаких прямых методов диагностики герпес-вирусной инфекции (с обнаружением ДНК или антигенов) на хронической и тем более латентной стадии.
Применение серологического тестирования ограничено по следующим причинам. Первое, антитела вырабатываются к 20-30 дню после первичной инфекции. Второе, уровень антител может быть низкий, независимо от того в какой стадии, острой или хронической, находится животное. Третье, из-за широкого распространения в природе герпес-вируса и применения вакцинации, многие кошки серопозитивны (т.е. имеют положительный титр специфических АТ).

Требования к пробе: Обратите внимание. Перед сбором материала для ПЦР нельзя использовать флюоресцин и местные анестетики, так как они влияют анализа (ингибируют процесс амплификации НК). — наиболее информативен смывы с коньюктив глаз. — при отсутствии поражений в ротовой полости рекомендуем воздержаться от сбора материала из рта! Общие правила взятия смывов: — смывы с конъюнктивы глаз берется с использовнаием стерильных зондов с ватными тампонами и стерильных пробирок объемом типа Эппендор на 1,5 мл, содержащие 300-500 мкл стерильного физиологического раствора. При наличии на веках корочек или гноя предварительно убрать их стерильной салфеткой смоченной физиологическим раствором. Зонд смочить в жидкости и отжать влагу, прислоняя ватный наконечник к внутренней стенке пробирки. Оттянув веко животного, провести зондом по слизистой века по направлению к носу обмывая глазное яблоко. Тщательно прополоскать зонд в пробирке и аккуратно отжать лишнюю влагу, прижимая наконечник к внутренней стенке пробирки. Тем же ватным зондом повторить процедуру с каждым веком обоих глаз, собирая материал в одну и ту же пробирку. Зонд утилизировать, пробирку плотно закрыть крышкой до щелчка. — Смывы с носовой и ротовой полости берутся аналогично. Для смывов из ротовой полости при отсутствии эррозий предпочтение отдается верхнему своду (небу), так как нижняя челюсть, подъязычная область обсеменены бактериальной микрофлорой. Избегать попадание слюнной жидкости в пробирку с транспортной средой. КАТЕГОРИЧЕСКИ запрещено: оставлять ватные зонды в пробирке при предоставлении проб в лабораторию Хранение и доставка: Материал для анализов доставляется в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при +2-+8⁰С. FHV инфекция часто представлена в комбинации с калицивирусной инфекцией и/или инфекцией Chlamydophila felis, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma spp., поэтому рекомендуется одновременное исследование с этими патогенами. Другие микроорганизмы, включая Staphylococcus spp. и Escherichia coli, могут приводить к так называемой мультиагентной вторичной инфекции респираторного тракта.

1. Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо после вакцинации выдержать минимум 2-3 недели перед сдачей анализа. 2. Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо выдержать 2-3 недели после лечения перед сдачей анализа. Контроль за болезнью Для домашних кошек, живущих в группе или в приюте: Всех новых кошек с характерными клиническими симптомами необходимо тестировать методом ПЦР, так как высока опасность распространения инфекции. Экспериментально доказано, что при введении в группу особей выделяющих вирус в количестве 4 % от общей численности всей группы, через 1 неделю количество кошек, выделяющих вирус увеличится до 50 %. Поэтому для вновь прибывших необходим карантин – как минимум 3 недели. Для клинически здоровых кошек предписана вакцинация. При возникновении вспышки инфекции необходимо провести дифференциальную диагностику герпес вирусной инфекции (FHV) от калицивирусной инфекции (FCV) Для владельцев питомников: Наибольший риск инфицирования и развития болезни у котят до отъема – 4-8 недель, когда падает материнский иммунитет. Источник инфекции – кошки-латентные носители инфекции, в которых прошла реактивация вируса на фоне лактации. Однако, кошки с достаточным уровнем защитных АТ (тестирование на определение титра АТ) передадут защитный уровень материнских АТ с молозивом, что гарантирует сопротивляемость организма котят к герпесвирусной инфекции на первых неделях жизни. ВАЖНО! 1. Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо выдержать 2-3 недели после лечения перед сдачей анализа. 2. Положительный результат при отсутствии клинической картины заболевания может означать бактерио-/вирусоносительство.

Домашние кошки – основной хозяин FHV, но этот вирус также был выделен от гепардов и львов.

Вирус ринотрахеита кошек

Таксономия, этапы репродукции вируса ринотрахеита кошек. Основной путь заражения. Особенности культивирования в различных живых системах. Клинические признаки заболевания. Принципы диагностики герпес-вирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции.

Артикул	Наименование услуг	Цена, руб.	Доступность экспресс	Ед. измер.	Материалы	Заказать
008	Вирусный ринотрахеит кошек (FHV-1) (ПЦР)	600 p (Время исполнения до 72 часов)	1 исслед.	E

Рубрика	Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид	реферат
Язык	русский
Дата добавления	02.06.2020
Размер файла	1,6 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Кафедра радиобиологии и вирусологии имени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина

по дисциплине «вирусология и биотехнология»

«ВИРУС РИНОТРАХЕИТА КОШЕК»

Исполнитель: студент 3 курса ФВМ 2 группы Колтыгин С.М.

1. Характеристика вируса

1.1 Таксономия вируса

1.2 Морфология вириона

1.3 Этапы репродукции вируса

1.4 Антигенная структура и вариабельность

1.5 Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства

1.6 Особенности культивирования в различных живых системах

1.7 Органный патогенез

2. Диагностика болезни

2.1 Постановка предварительного диагноза

2.2 Виды патологического материала

2.3 Этапы лабораторной диагностики

3. Специфическая профилактика

Список использованной литературы

Ринотрахеит кошек — остро и хронически протекающая контагиозная болезнь кошек, характеризующаяся лихорадкой, катаральным воспалением верхних дыхательных путей и поражением глаз.

Вирусные респираторные инфекции кошек широко распространены. Заболевают только представители семейства кошачьих, в частности кошки всех пород независимо от возраста, однако наиболее чувствительны животные в возрасте от 2 месяцев до 1 года, но котята-сосуны иногда обладают слабым иммунитетом, полученным от матери. При групповом содержании болезнь может значительно распространяться и приобретать характер постоянной энзоотии. Заболевание чаще регистрируется в холодное время года и в периоды дождей.

Источником возбудителя инфекции служат больные животные и вирусоносители. В дыхательных путях выздоровевших кошек вирус обнаруживается до 50 дней. Возможно латентное носительство. У кошек возбудитель может находиться на слизистых оболочках дыхательных путей. Под воздействием на организм различных стресс-факторов, особенно простуды, возникает клинически выраженное заболевание. Распространению возбудителя инфекции среди популяции домашних кошек способствуют концентрация животных в питомниках по их разведению, перегруппировки, выставки, вязки и другие мероприятия, сопровождающиеся стрессами, при которых происходит реактивация вируса из латентного состояния, сопровождающаяся его репликацией и экскрецией во внешнюю среду с носовыми, глазными и вагинальными выделениями, а также слюной животных.

1. Характеристика вируса

1.1 Таксономия вируса

Вид — Felidherpesvirus 1 (FHV).

1.2 Морфология вириона

Вирион представляет собой частицы сферической формы, кубического типа симметрии, которая имеет липидную суперкапсидную и наружную оболочки. Наружная оболочка вирионов содержит многочисленные выступы (шипы) длиной 8нм. Сложная организация вириона: ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком, капсид, суперкапсидная оболочка и наружная оболочка, имеющая выступы — гликопротеиновые шипы. Геном — двуспиральная линейная ДНК. Размер данного возбудителя составляет 151 — 225 нм.

В составе вириона определено до 32 белков.

Устойчивость вируса: 4?С — 154 дня, 25?С — 33 дня, 37?С — 36 часов, 56?С — 4 — 5 минут. Также он чувствителен к хлороформу и кислым значениям рН, не устойчив к формальдегиду.

1.3 Этапы репродукции вируса

Репродукция вируса ринотрахеита кошек проходит в ядре и цитоплазме:

1. Адсорбция вируса на клетке;

2. Проникновение вируса в клетку (путем слияния);

3. Депротеинизация на ядерных порах;

4. Транскрипция — синтез и-РНК (ранняя и поздняя);

5. Трансляция — синтез ранних и поздних белков и ферментов в цитоплазме;

6. Репликация — синтез двуспиральной ДНК в ядре;

7. Сборка вириона (формирующийсякапсид заполняется ДНК и почкуется через модифицированные мембраны ядерной оболочки в цитоплазму);

8. Выход вируса из клетки (путем экзоцитоза или лизиса)

1.4 Антигенная структура и вариабельность

1.5 Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства

1.6 Особенности культивирования в различных живых системах

Культивирование проводят в КК эмбрионов котят и почек кошки, где цитопатогенные изменения в зараженной культуре развиваются уже через одни сутки и характеризуются образованием больших, рефрактильных клеток синцития с 10—20 ядрами и внутриядерными тельцами-включениями; в клетках естественно резистентных организмов (крупного рогатого скота, человека, обезьяны) вирус РТК также может репродуцироваться с образованием гигантских клеток и внутриклеточных включений, однако инфекционного вируса из таких клеток выделить не удается. Возможно репродуцирование вируса РТК в организме кошек 4—6-месячного возраста. У животных развивается типичный респираторный синдром верхних дыхательных путей и появляются вируснейтрализующие антитела. У беременных кошек происходят аборты или рождаются мертвые котята, содержащие вирус. У котят при внутривенном заражении в местах остеогенеза в костях отмечаются остеомиелические поражения и может быть выделен вирус.

Вирус образует внутриядерные включения.

1.7 Органный патогенез

Детально не изучен.

Основным местом внедрения вируса является эпителий слизистых оболочек верхних дыхательных путей, ротовой полости и конъюнктивы глаз. Попав на слизистые оболочки, вирус проникает в клетки эпителия, репродуцируется, вызывая их гибель и слущивание. Кроме того, герпес-вирус кошек тропичен к растущим частям скелета, включая носовую раковину.

Герпесвирус (FVR) локализуется и размножается в основном в эпителии глотки. При стрессе (болезнь, анестезия, операция, период лактации) иммунный барьер кошки нарушается, и вирус начинает выделяться со слюной во внешнюю среду.

В дальнейшем возникает воспалительная реакция, на поверхности слизистой оболочки образуются вначале мелкие, а затем более обширные участки некроза. Адсорбируясь на лейкоцитах, вирус попадает в кровь и вызывает вирусемию, проявляющуюся общим угнетением и лихорадкой.

При проникновении вируса через плацентарный и гематоэнцефалический барьеры возникает поражение мозга, плаценты, матки и плода. Патологический процесс при инфекционном ринотрахеите во многом зависит от осложнений условно-патогенной микрофлорой, проявляющихся развитием бронхита, пневмоний, гастрита и энтерита.

Течение болезни обостряется при смешанной инфекции с аденовирусами и возбудителем панлейкопении.

В дыхательных путях выздоровевших кошек вирус обнаруживается до 50 дней. У кошек возбудитель может находиться на слизистых оболочках дыхательных путей.

2. Диагностика болезни

2.1 Постановка предварительного диагноза

Инфекционный ринотрахеит кошек, как и другие вирусные респираторные инфекции широко распространены. Заболевание поражает всех из семейства кошачьих, болеют все породы кошек независимо от возраста, за исключением котят-сосунов до 2-х месячного возраста получающих антитела от матери с молозивом (коллостральный иммунитет). При групповом содержание кошек (приюты, кошачьи питомники) болезнь может быстро распространяться, приобретая при этом характер постоянных энзоотий. Пик заболевания у кошек приходится на холодное и дождливое время года (зима, начало весны, конец осени).

Риск заразиться ИРТ резко повышается, если кошка будет посещать выставки или бесконтрольно спариваться с котами, у которых в семенной жидкости содержится возбудитель ИРТ. К группе риска можно отнести кошек ослабленным стрессом или болезнью, кошки живущие скученно (идет перекрестное перезаражение), неполноценное кормление, котята и молодые кошки от 2месяцев до 1года. Источником ИРТ кошек являются больные и вирусоносители ИРТ кошки. В дыхательных путях выздоровевших кошек возбудитель ИРТ обнаруживается до 50 дней. У кошек возможно скрытое носительство. В результате того или иного стресса в организме кошки происходит реактивация вируса с последующим выделением его во внешнею среду. Здоровым кошкам вирус ИРТ передается при непосредственном контакте с больными животными через выделения из носа, рта и глаз.

Основной путь заражения — аэрогенный, который способствует быстрому распространению ИРТ. Путями передачи могут служить корма, предметы ухода, люди имевшие контакт с больными животными, инфицированный воздух.

Инкубационный период при ИРТ составляет 3?8дней. ИРТ может протекать у кошки остро, подостро и хронически.

При остром течение ИРТ у кошки наблюдается повышение температуры тела до 39,5?40 градусов, которая держится у нее в течение 2?3дней. В дальнейшем начинает развиваться конъюнктивит, ринит, кашель, хрипота, при этом у больных кошек часто бывают обильные гнойные истечения из глаз и носа. У отдельных больных кошек скопление экссудата в глотке приводит к рвоте. У некоторых животных наблюдается слюнотечение и образование мелких язв на дорсальной части языка. При пальпации в области гортани и трахеи отмечается болезненность. Прием пищи и воды у больной кошки затруднен. Выздоровление обычно наступает через 7?10дней после начала болезни. Если болезнь затягивается, у кошки начинается атония кишечника, появляются запоры. У отдельных кошек ИРТ принимает хроническое течение и диагностируется ветспециалистами годами. Из осложнений ИРТ регистрируют бронхопневмонию, язвенный кератит, изъязвление кожи и расстройство центральной нервной системы, проявляющееся дрожанием конечностей, а также манежными движениями. У беременных кошек возможны аборты и рождение мертвых котят.

В верхних дыхательных путях и глазах отмечаются признаки катарального, экссудативного, некротического и фибринозного поражений. Характерные для ИТР изменения наблюдаются в трахее (слизистая оболочка утолщена, с кровоизлияниями). У больных котят обнаруживаем признаки интерстициальной пневмонии, конъюнктивита (вплоть до разрушения роговицы). При проведении гистологического исследования находим некротические изменения в мерцательном эпителии слизистой оболочки носовой полости, раковин, гортани, при более тяжелом течении болезни- в плоском эпителии носоглоточного кольца, в тканях трахеи, бронхов и частично бронхиол. В эпителиальных клетках, слизистой оболочке респираторного тракта и конъюнктивы обнаруживают внутриядерные ацидофильные тельца-включения типа А. Каудри.

При вскрытии павших животных в носовых ходах находится гнойно-фибринозный экссудат, закрывающий просвет ходов. Под экссудатом слизистая оболочка шероховатая, красного цвета, местами изъязвлена. Подобным образом выглядит и слизистая оболочка трахеи. Миндалины увеличены, пронизаны кровоизлияниями. Заглоточные и подчелюстные лимфатические узлы увеличены, отечны, окрашены в красный цвет. Пневмония регистрируется в двух вариантах. При герпетической форме пневмонии преобладают некротические процессы и серозно-фибринозная экссудация. В долях легких находят многочисленные уплотненные очаги серо-красного цвета. При разрезе легкого в этих участках с поверхности разреза выделяется немного мутной серовато-красной жидкости. При других формах, когда герпесвирусная инфекция осложнена бактериями или кокками (а осложнения вызывают обычно пастереллы, бордетеллы, стафилококки, микоплазмы и хламидии), пневмония носит характер катарально-фибринозно-гнойной бронхопневмонии. При этом с поверхности разреза легких и бронхов выделяется густой серовато-белый экссудат, напоминающий слизь и гной.

Диагноз основан на анализе эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований полимеразной цепной реакции (ПЦР) истечений изо рта, носа, глаз и выделении вируса в культуре клеток.

2.2 Виды патологического материала

От живого животного.

Смывы носовые, глазные, кровь на парные сыворотки.

Паренхиматозные органы и лимфоузлы.

2.3 Этапы лабораторной диагностики

Индикация вируса осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунной флуоресценции (РИФ).

Реакция иммунной флуоресценции (РИФ).

Сэндвич вариант: К антигену добавляют антитела, образуется комплекс антиген-антитело к нему добавляют специфический конъюгат, после чего образуется комплекс-специфический конъюгат к которому добавляют субстрат.

Непрямой вариант: АТ+АГ образуется комплекс АТ-АГ к которому добавляют антивидовой конъюгат в результате образуется комплекс-антивидовой конъюгат к которому добавляют субстрат.

РИФ, предложенную Кунсом еще в 1942 году, трудно отнести к новым методам исследования. Но благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела, РИФ получила в настоящее время вторую жизнь, ее чувствительность и специфичность значительно увеличены.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего она используется для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала как для обычной микроскопии готовят мазок на предметном стекле. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят меченые ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой РИФ сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе (антивидовыми)). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован помимо обнаружения антигена и для обнаружения антител. В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязанные антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов (антивидовой). В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Рис. 2 РИФ при диагностике FHV-1: а). Клетки, инфицированные вирусом FHV-1; б). Скопление клеточных мембран инфицированных клеток.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ПЦР диагностика — предпочтительный метод диагностики герпес-вирусной инфекции на острой стадии, основанный на выделении ДНК FHV из смывов с конюънктивы, носоглотки, соскобов с роговицы.

Важным этапом в совершенствовании методов диагностики инфекционных заболеваний явилась разработка методов, позволяющих обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Создание принципиально нового способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), открыло новые возможности для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мюллисом. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки — олигонуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидных пар (праймеры). Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n — число циклов амплификации. Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации (состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и построения фрагмента). В результате 30-35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагментов, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном гелях. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаруживать единичные бактериальные клетки или вирусные частицы. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.

Метод ПЦР превосходит метод выделения вируса на культурах клеток, особенно в случае бактериальной контаминации, которая мешает традиционной технике культивирования; более чувствителен и менее трудоемок.

Наличие вторичной бактериальной и грибковой инфекции может осложнять и маскировать первичную вирусную инфекцию, затрудняя клиническую диагностику. Таким образом, существенным является возможность определения вирусных протеинов или вирусной ДНК для подтверждения диагноза первичной вирусной инфекции. ПЦР может являться одним из методов подтверждения FHV-1 инфекции в гистологических образцах в подозрительных случаях.

К сожалению, диагностика FHV-1 инфекции с помощью ПЦР-амплификации имеет ограниченную клиническую ценность, поскольку могут выявляться латентные инфекции, широко распространенные у кошек, таким образом, невозможно будет определить, играет ли FHV-1 первичную роль в возникновении заболевания, или же он просто реактивировался из латентного состояния под действием стресса или сопутствующей инфекции. Немалую роль в ограничении использования ПЦР является дороговизна оборудования и реактивов, высокая требовательность к качеству реактивов, строжайшие требования к помещениям и организации работы в ПЦР-лаборатории для исключения контаминации образцов продуктами амплификации.

Выделение вируса на культуре клеток.

В 1958 году CrandellandMaurer продемонстрировали, что вирус FHV-1 растет и вызывает цитопатический эффект в культуре клеток почки кошки, что позволило создать invitro систему для выделения и изучения свойств FHV-1.

Для выделения вируса FHV-1 мазок берут с поверхности конъюнктивы или слизистой оболочки ротоглотки, обычно используют стерильные тампоны из хлопка или дакрона. Сразу после взятия пробы тампон помещают в пробирку с 1-1,5 мл вирусной транспортной среды с антибиотиками. При необходимости пробы замораживают и сохраняют при -70оС. Для выделения вируса обычно используют культуру клеток почки кошки CrFK, выращенную на плашках (рис. 3).

Рис. 3. Перевиваемая культура клеток почки кошки — CrFK.

Зараженную культуру клеток инкубируют при 37оС и 5% СО2 в течение 10 дней, просматривая каждые 24-48 часов для обнаружения признаков цитопатического действия вируса ВРТ кошек (рис. 4.)

Рис. 4. Цитопатическое действие вируса FHV-1, штамм «Гранд» на культуру клеток CrFK: а). ЦПД вируса через 48ч после инокуляции, б). ЦПД вируса через 72 ч после инокуляции.

Для подтверждения и идентификации выделенного изолята вируса FHV-1 используют метод иммунофлюоресценции со специфической антисывороткой, а также электронную микроскопию.

Основными недостатками метода выделения вируса на культурах клеток являются: длительность (до 10 дней), высокая трудоемкость, сложность, высокая стоимость, невозможность выделения вируса в случае бактериальной контаминации образцов.

Вероятно, что незрелый, необладающий достаточной инфекционностью вирус, продуцируемый на некоторых стадиях FHV-1-инфекции, ограничивает чувствительность традиционного метода выделения вируса. В дополнение к этому разрушение оболочек вирионов при транспортировке, связывание вируса антителами (образование комплекса вирус-антитело) на поверхности слизистых оболочек и деградация ферментами слюны и слезы кошек также в некоторых случаях являются возможным объяснением низкой чувствительности метода выделения вируса на культурах клеток.

Идентификация выделенного вируса проводят методами ПЦР и реакцией нейтрализации (РН).

Ретроспективная диагностика. Иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА — специфичный и универсальный метод, отличающийся высокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов. В ИФА первый известный компонент (антитело или антиген) сорбируют на твердую фазу. Следующие компоненты, включая исследуемые пробы, вносят последовательно в жидком растворенном виде. Сформировавшиеся после инкубации иммунные комплексы антиген-антитело отделяют от непрореагировавших компонентов реакции при отмывании планшет. В ИФА используют противовирусные или антивидовые антитела, меченые пероксидазой хрена (ПХ) или другими ферментами, которые затем выявляются различными субстратами (диаминобензидин, 5-аминосалициловая кислота, о-фенилендиамин). Изменение цвета регистрируется визуально или спектрофотометрически, что дает возможность проводить количественный учет результатов анализа.

Разработаны различные варианты ИФА: прямые, непрямые, методы блокирования и конкурентные. В прямых вариантах используют меченые ферментом противовирусные антитела, в непрямых — антивидовыеконъюгаты. В конкурентном варианте и методе блокирования типирование и титрование исследуемых антигенов и антител обеспечивается за счет вытеснения с их помощью определенного количества меченого антигена или антитела.

Для обнаружения антител к FHV-1 ИФА ставят на многолуночныхмикротитровальных плашках, сенсибилизированных антигеном FHV-1 по стандартной методике. Используют как моноклональные антитела, так и поликлональные анти-кошачьи IgG, в качестве ферментной метки чаще всего используют пероксидазу хрена. Определения показателя абсорбции проводят на автоматическом ИФА-ридере с фильтром 492 нм.

ИФА — универсальный, и на сегодняшний день наиболее чувствительный и совершенный метод определения антител к FHV-1 у кошек.

3. Специфическая профилактика

Для профилактики заболевания предложены живые и инактивированные вакцины. Первые готовят из аттенуированного штамма вируса, размноженного в культуре клеток почек котят. Для аттенуации вирулентного штамма вируса требуется не менее 50 пассажей при температуре 33-35°С. Живая сухая вакцина, полученная из такого штамма, безопасна и высокоэффективна.

Используют три типа вакцин: живую аттенуированную для парентерального введения; живую вакцину для интраназального введения и инактивированную вакцину с адъювантом для парентерального введения.

Начиная с 4-5 суток после введения, живые вакцины создают у восприимчивых животных устойчивость к заражению. Негативной стороной применения живых вакцин является возможность поствакцинальных реакций и экскреция вакцинного вируса в окружающую среду в течение первых шести суток после прививки.

Вакцинация кошек инактивированными вакцинами создает напряженный иммунитет продолжительностью 12 месяцев через две недели после второй инъекции вакцины (интервал между введением вакцины составляет 3 недели). При этом данные иммунобиологические препараты полностью лишены негативных последствий, которые имеются у живых вакцин.

Для активной иммунопрофилактики кошек применяют комбинированные (ассоциированные) аттенуированные вакцины из штамма F-2 — «Мультифел-3» (против панлейкопении, ринотрахеита и калицивирусной инфекции кошек), «Мультифел-4» (против панлейкопении, ринотрахеита и калицивирусной инфекции и хламидиоза кошек); НобивакТрикэт (ринотрахеита, калицивироза, панлейкопении); Корифелин (герпесвирус, калицивироз); Леукорифелин (герпесвирус, калицивироз, панлейкопения); Квадрикат (бешенство, калицивироз, герпесвирус, панлейкопения).

Котята должны подвергаться вакцинации первоначально в возрасте 9 недель с последующей ревакцинацией через 3-4 недели. Иммунитет сохраняется до года. Взрослые кошки прививаются однократно ежегодно. Иммунитет у привитых животных наступает через 14 дней после второй иммунизации и сохраняется в течение 1 года

Для серопрофилактики применяют препараты «Витафел» и «Витафел-С».

Учеными ведутся разработки по созданию на основе герпесвируса кошек типа 1 эффективных векторных систем для экспрессии протективных антигенов вирусов лейкоза кошек (FeLV) и иммунодефицита кошек (FIV) в клетках эукариот.

вирус ринотрахеит инфекция

Вирус ринотрахеита кошек занимает одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний кошек. Одним из важнейших фактором является быстрый и точный диагноз при лечении болезни. Применение методов иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа для диагностики FHV-1 открывает новые перспективы в изучении и контроле этого серьезного заболевания.

Список использованной литературы

1. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Вашутин, Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. — М.: КолосС, 2020. — 671 с, [18] л. ил.: ил. — (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

2. Пособие по ветеринарной вирусологии/ Р.В. Белоусова, И.В. Третьякова, М.С. Калмыкова, Е.И. Ярыгина

Размещено на Allbest.ru

Подобные документы

Особенности и сущность ринотрахеита кошек, его идентификация, основные возбудители, распространение, влияние на организм, осложнения, патологоанатомические признаки, диагностика, профилактика и лечение. Общая профилактика инфекционных болезней кошек.

реферат [17,1 K], добавлен 26.09.2020

Исследование особенностей развития вирусных инфекций домашних кошек. Изучение этиологии, патогенеза и клинических признаков инфекционного ринотрахеита. Характеристика эпизоотической ситуации по данным частной ветеринарной клиники «Теремок» г. Луганска.

курсовая работа [40,7 K], добавлен 17.03.2020

Понятие панлейкопении кошек как высококонтагиозной, вирусной, остропротекающей болезни. Поражение желудочно-кишечного тракта, респираторных органов, сердца. Общая интоксикация, обезвоживание и высокая летальность. Клинические симптомы заболевания.

презентация [2,4 M], добавлен 18.05.2020

Эпизоотическая характеристика инфекционных болезней кошек, понятие их специфической профилактики. Особенности эпизоотологического и клинического проявления кальцивирусной инфекции у кошек. Анализ результатов лечения кошек, больных кальцивирозом.

дипломная работа [130,1 K], добавлен 16.05.2020

Общие сведения о дерматофитозах, их экологическая классификация. Источники возбудителя инфекции. Клинические признаки заболевания кошек, инкубационный период микроспории. Эпизоотологические данные, результаты люминесцентного и лабораторного исследований.

курсовая работа [770,4 K], добавлен 08.03.2020

Изучение этиологии, общая характеристика и определение клинических признаков панлейкопении кошек как острозаразной вирусной болезни, характеризующейся поражением кишечника. Дифференциальная диагностика, лечение и система профилактики панлейкопении кошек.

реферат [18,1 K], добавлен 20.01.2020

Общая характеристика болезней ушей у кошек, их классификация и разновидности, главные причины возникновения. Этиология и патогенез отита кошек, причины возникновения, принципы диагностики и меры профилактики. Основные правила ухода за ушами кошек.

курсовая работа [77,7 K], добавлен 31.03.2020

Первостепенные источники инвазии для человека. Возрастная динамика описторхоза и дипилидиоза. Различия в экстенсивности и в интенсивности заражения кошек в районах с различной степенью урбанизации. Воспалительная реакция в тонком кишечнике кошек.

статья [193,4 K], добавлен 18.07.2020

Предпосылки возникновения и клинические проявления инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, его эпизоотология и степень опасности для жизни заболевших животных. Формы проявления и места локации вирусной инфекции, методы лечения и профилактики.

реферат [16,8 K], добавлен 20.09.2020

Инфекционные заболевания сельскохозяйственных животных и птиц. Морфология и химический состав вируса ящера, клинические признаки заболевания. Алиментарный и респираторный пути заражения животных, патологические изменения и дифференциальная диагностика.

курсовая работа [56,4 K], добавлен 11.12.2020

Разработаны различные варианты ИФА: прямые, непрямые, методы блокирования и конкурентные. В прямых вариантах используют меченые ферментом противовирусные антитела, в непрямых — антивидовыеконъюгаты. В конкурентном варианте и методе блокирования типирование и титрование исследуемых антигенов и антител обеспечивается за счет вытеснения с их помощью определенного количества меченого антигена или антитела.